Small molecular interaction_ VMD (分子動態模擬軟體)

本課堂用簡單的應用做為範例：模擬蛋白質與水分子的交互作用。

1. 先上PDB網站 http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do 尋找一個有興趣的protein，並記下其結構代碼。
   本次以E. coli 的CsrA蛋白(代碼1Y00)為例，因為Clostridium difficile 的CsrA蛋白還沒被發表。
   
   
2. 開啟VMD程式，由於VMD可自動從網路上抓檔案，因此只需打上查好的蛋白代碼1Y00，即可叫出檔案，接著視窗會顯示出此蛋白的3D模擬圖。
   
   
   
3. 先建立一個此分子的 psf 檔。Extensions > Modelling > Automatic PSF Builder，Load input files>  Guess and split chains using current selections> Create chains> Apply patches and finish PSF/PDB，或是直接按右下角 I'm feeling lucky也可做出 psf 檔 。
   
   
4. 建立water box。步驟如下：Extensions > Modelling > Add Solvation Box，勾選 Rotate to minimize volume，在 Box size 都輸入15A，按 Solvate。
   
   圖示：加上water box前
   
   
   
   圖示：加上 water box 後，protein周圍多了一些紅白組成的水分子，也增加了一個 solvate.psf 的檔案。
   
   
   
5. 也可以Neutralize protein，步驟：Extensions > Modelling > add Ions，按Autoionize。
   
   

Phylogenetic Tree 繪製物種親緣關係樹 (建立關係樹)

延續之前載下的7個胺基酸序列(有相似的CsrA序列的菌株)建立親緣關係樹。流程圖如下：

1. 打開 phylip-3.69中的 exe資料夾，將之前的 infile.phy的副檔名刪除。
   
   
2. 開啟 seqboot.exe，會出現以下畫面，再依序輸入指令: R > Enter > Numbers of replicates > 200 > Y > Enter > Random number seed > 1
   
   接著會得到一個outfile檔案，將原本infile檔名改成其他名稱(例：CsrA-01)，再將outfile改成infile檔名，方便下個程式開啟。
   
   
3. 打開 protdist.exe程式，如下圖所示，輸入指令: M > multiple data sets (type D) > How many data sets > 200 > Y
   等待系統作業，之後會得到另一個outfile，將上個infile檔名改成其他名稱(CsrA-02)，再將outfile改成infile檔名，方便下個程式開啟。
   
   
4. 打開 neighbor.exe程式，輸入指令: M > How many data sets > 200 > Random number seed > 1 > Y，之後會得到outfile及outtree兩個檔案。
   
   
5. 把之前infile及outfile檔名都改掉，並將 outtree檔名改成 intree，方便下個程式開啟。
   開啟consense.exe程式，輸入指令"Y"後程式會產生 "outfile" 及 "outtree" 兩個檔案。
   
   
   
6. 可用兩種程式開啟outtree，"TreeViewX"和"hypertree-1.2.2"。
   
   
   
   

miRNA 的 predict

1. 進入 miRTarBase 網站http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/，這是ㄧ個microRNA的資料庫，可搜尋欲分析的miRNA，例：hsa-miR-18a-5p。
   
2. 一個miRNA可能作用多個Target。
   
   
3. 相對的，也可從Target去找miRNA，開啟 RNA22 v2 網站https://cm.jefferson.edu/rna22v2/ 選擇view pre-computed static RNA22 v2 predictions。
   
   
4. 選擇HOMO SAPIENS>輸入Gene Name，例：CSRNP3(剛才在miRTarBase 找到的 hsa-miR-18a-5p 的 Target之一) > Submit
   
   
   
   
5. 選擇 View Predictions as cDNA map ，在下拉式選單中找到 hsa-miR-18a-5p
   
   
   
6. RNAfold web sever 此網站 http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi可用來預測microRNA可能的structure。
   
   
   
   
   
   

Phylogenetic Tree 繪製物種親緣關係樹 (搜尋與儲存序列)

進入NCBI BLAST 網站，可在資料庫中搜尋到和目標基因相似的序列，在此以Clostridium difficile  R20291 的(carbon storage regulator A) CsrA基因為例。

1. NCBI BLAST 網站，點選下方的 nucleotide blast。
   
   
2. 貼上Clostridium difficile 的(carbon storage regulator A) CsrA基因序列，並且在 " Program selection"選擇 More dissimilar sequences (discontiguous megablast)可搜尋到較多的序列，選擇"Show results in a new window"、"BLAST"。
   
   
3. 幾分鐘後BLAST的結果出爐，系統會列出一個清單，上面顯示相似的基因序列以及其物種，依相似性由高到低排列。
   
   
4. 勾選感興趣的 (例:7個) 相似CsrA序列的菌株，按Download, FASTA (aligned sequences)，下載後用BioEdit程式開啟檔案。
   (!!!序列名稱盡可能簡短，避免後續建立親緣關係樹時造成程式誤會)
   
   點選Accessory Application > ClustalW Multiple Alignment > RunClustalW> 完成alignment 。
   
   
5. 儲存檔案：File > Save as > phylip-3.69資料夾 > exe資料夾 > 檔名改Infile.phy (Phylip 4 格式)