Small molecular interaction_ VMD (分子動態模擬軟體)

本課堂用簡單的應用做為範例：模擬蛋白質與水分子的交互作用。

1. 先上PDB網站 http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do 尋找一個有興趣的protein，並記下其結構代碼。
   本次以E. coli 的CsrA蛋白(代碼1Y00)為例，因為Clostridium difficile 的CsrA蛋白還沒被發表。
   
   
2. 開啟VMD程式，由於VMD可自動從網路上抓檔案，因此只需打上查好的蛋白代碼1Y00，即可叫出檔案，接著視窗會顯示出此蛋白的3D模擬圖。
   
   
   
3. 先建立一個此分子的 psf 檔。Extensions > Modelling > Automatic PSF Builder，Load input files>  Guess and split chains using current selections> Create chains> Apply patches and finish PSF/PDB，或是直接按右下角 I'm feeling lucky也可做出 psf 檔 。
   
   
4. 建立water box。步驟如下：Extensions > Modelling > Add Solvation Box，勾選 Rotate to minimize volume，在 Box size 都輸入15A，按 Solvate。
   
   圖示：加上water box前
   
   
   
   圖示：加上 water box 後，protein周圍多了一些紅白組成的水分子，也增加了一個 solvate.psf 的檔案。
   
   
   
5. 也可以Neutralize protein，步驟：Extensions > Modelling > add Ions，按Autoionize。
   
   

Phylogenetic Tree 繪製物種親緣關係樹 (建立關係樹)

延續之前載下的7個胺基酸序列(有相似的CsrA序列的菌株)建立親緣關係樹。流程圖如下：

1. 打開 phylip-3.69中的 exe資料夾，將之前的 infile.phy的副檔名刪除。
   
   
2. 開啟 seqboot.exe，會出現以下畫面，再依序輸入指令: R > Enter > Numbers of replicates > 200 > Y > Enter > Random number seed > 1
   
   接著會得到一個outfile檔案，將原本infile檔名改成其他名稱(例：CsrA-01)，再將outfile改成infile檔名，方便下個程式開啟。
   
   
3. 打開 protdist.exe程式，如下圖所示，輸入指令: M > multiple data sets (type D) > How many data sets > 200 > Y
   等待系統作業，之後會得到另一個outfile，將上個infile檔名改成其他名稱(CsrA-02)，再將outfile改成infile檔名，方便下個程式開啟。
   
   
4. 打開 neighbor.exe程式，輸入指令: M > How many data sets > 200 > Random number seed > 1 > Y，之後會得到outfile及outtree兩個檔案。
   
   
5. 把之前infile及outfile檔名都改掉，並將 outtree檔名改成 intree，方便下個程式開啟。
   開啟consense.exe程式，輸入指令"Y"後程式會產生 "outfile" 及 "outtree" 兩個檔案。
   
   
   
6. 可用兩種程式開啟outtree，"TreeViewX"和"hypertree-1.2.2"。
   
   
   
   

miRNA 的 predict

1. 進入 miRTarBase 網站http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/，這是ㄧ個microRNA的資料庫，可搜尋欲分析的miRNA，例：hsa-miR-18a-5p。
   
2. 一個miRNA可能作用多個Target。
   
   
3. 相對的，也可從Target去找miRNA，開啟 RNA22 v2 網站https://cm.jefferson.edu/rna22v2/ 選擇view pre-computed static RNA22 v2 predictions。
   
   
4. 選擇HOMO SAPIENS>輸入Gene Name，例：CSRNP3(剛才在miRTarBase 找到的 hsa-miR-18a-5p 的 Target之一) > Submit
   
   
   
   
5. 選擇 View Predictions as cDNA map ，在下拉式選單中找到 hsa-miR-18a-5p
   
   
   
6. RNAfold web sever 此網站 http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi可用來預測microRNA可能的structure。
   
   
   
   
   
   

Phylogenetic Tree 繪製物種親緣關係樹 (搜尋與儲存序列)

進入NCBI BLAST 網站，可在資料庫中搜尋到和目標基因相似的序列，在此以Clostridium difficile  R20291 的(carbon storage regulator A) CsrA基因為例。

1. NCBI BLAST 網站，點選下方的 nucleotide blast。
   
   
2. 貼上Clostridium difficile 的(carbon storage regulator A) CsrA基因序列，並且在 " Program selection"選擇 More dissimilar sequences (discontiguous megablast)可搜尋到較多的序列，選擇"Show results in a new window"、"BLAST"。
   
   
3. 幾分鐘後BLAST的結果出爐，系統會列出一個清單，上面顯示相似的基因序列以及其物種，依相似性由高到低排列。
   
   
4. 勾選感興趣的 (例:7個) 相似CsrA序列的菌株，按Download, FASTA (aligned sequences)，下載後用BioEdit程式開啟檔案。
   (!!!序列名稱盡可能簡短，避免後續建立親緣關係樹時造成程式誤會)
   
   點選Accessory Application > ClustalW Multiple Alignment > RunClustalW> 完成alignment 。
   
   
5. 儲存檔案：File > Save as > phylip-3.69資料夾 > exe資料夾 > 檔名改Infile.phy (Phylip 4 格式)
   
   

NCBI 和 CLC Sequence Viewer

1. 進入NCBI查詢想要的基因序列，例如：Clostridium difficile R20291
   這隻細菌的sortase B之基因。
   
   
2. 頁面往下拉，找到 "Genomic Sequence"，點選 "GenBank"
   
   
3. 出現關於這個基因的許多介紹，像是 gene ID、origin 原始的序列。
   
   
   
   
   
4. 點選左上 "Send" ，選 "File" 和 "Create File"，下載檔案到電腦中。
   
   
5. 開啟 CLC Sequence Viewer 軟體。
   
   
6. 將先前下載的檔案匯入。
   
   
7. 下方有許多種顯示的方式(紅框)，像是把基因顯示為環型。
   
   
   
   
8. 也可以利用左下方的 "Toolbox" 選單，像是可把DNA轉換為RNA、DNA轉換成 protein。
   
   
   
   

DisGeNET 基因與疾病資料庫應用

1. 首先，進入 DisGeNET的網站首頁，點選"Search"。
   
   
   
2. 搜尋基因與疾病的關係，本次以"NOD2"這個基因為例子，
   尋找有關這個基因的疾病。
   
   
   
3. 接著下方會出現"NOD2"的介紹，也會出現一些連結，
   像是"Top 10 disease associations for this gene"。
   
   
   
4. 點開"Top 10 disease associations for this gene"會出現疾病相關性排名，
   它會依最相關的疾病做排列，例：Synovitis granulomatous with uveitis and cranial neuropathies 。
   
   
   
5. 按左下角的"Browse details"可查詢更多與這個基因相關的疾病。
   
   
   
6. 可點選感興趣的疾病，連結到疾病的介紹。
   
   
   
7. 相反的，也可以輸入疾病，找尋最相關的基因，
   此功能可回推前面所找到的疾病，是否與這個基因有一致的相關性。